بیان و خالص‌سازی ژن نوترکیب Cold sensitive Taq DNA polymerase در E.coli
Authors
Abstract:
سابقه و هدف: آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت بعلت کاربرد آن در PCR و تحقیقات بیولوژی مولکولی توجه زیادی را به خود معطوف ساخته است و در نتیجه اهمیت مطالعه روی DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت مختلف را دو چندان نموده است. هدف از این مطالعه سنجش عملکرد و میزان تولید آنزیم DNA پلیمراز حساس به سرما و مقاوم به حرارت تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص‌سازی سریع و ارزان آن می‌باشد. مواد و روش‌ها: بعد از سنتز ژن طراحی شده به صورت مصنوعی، کلونینگ آن به داخل وکتور pET28a انجام شد. سپس پلاسمید حاوی ژن تولیدکننده آنزیم Taq DNA polymerase به سویه E.coli BL21 انتقال یافت. در این مطالعه از IPTG به عنوان القاءگر برای بیان ژن موردنظر استفاده شد. خالص‌سازی اولیه آنزیم توسط امواج اولتراسوند و در ادامه به وسیله شوک حرارتی در 72 درجه سانتی‌گراد و رسوب‌دهی سایر پروتئین‌های نامحلول به وسیله سانتریفوژ انجام گردید. فعالیت و عملکرد Taq DNA polymerase تولید شده در مقایسه با آنزیم تجاری مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: Taq DNA polymerase مقاوم به حرارت و حساس به سرمای نوترکیب بیان شده در E.coli، برتری قابل توجه و عملکرد بهتری نسبت به آنزیم تجاری از نظر فعالیت و مقاومت در برابر حرارت نشان داده است. نتیجه‌گیری: با توجه به اهمیت و سطح کاربرد آنزیم Taq DNA polymerase مقاوم به حرارت در مطالعات زیست‌شناسی مولکولی، روش مورد استفاده در تولید این آنزیم، روشی کاربردی و مقرون به صرفه می‌باشد. به علاوه، سهولت روش به کار گرفته شده و نیز صحت و دقت عمل آنزیم تولید شده، دلیل مناسب و قابل قبولی برای تولید آزمایشگاهی و محلی آنزیم cold sensitive Taq DNA polymerase با خلوص بالا می‌باشد.
similar resources
بیان و خالص سازی ژن نوترکیب cold sensitive taq dna polymerase در e.coli
سابقه و هدف: آنزیم dna پلیمراز مقاوم به حرارت بعلت کاربرد آن در pcr و تحقیقات بیولوژی مولکولی توجه زیادی را به خود معطوف ساخته است و در نتیجه اهمیت مطالعه روی dna پلیمرازهای مقاوم به حرارت مختلف را دو چندان نموده است. هدف از این مطالعه سنجش عملکرد و میزان تولید آنزیم dna پلیمراز حساس به سرما و مقاوم به حرارت تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص سازی سریع و ارزان آن می باشد. مواد و روش ها: بعد ا...
full textCold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR.
Although the thermophilic bacterium Thermus aquaticus grows optimally at 70 degrees C and cannot grow at moderate temperatures, its DNA polymerase I has significant activity at 20-37 degrees C. This activity is a bane to some PCRs, since it catalyzes non-specific priming. We report mutations of Klentaq (an N-terminal deletion variant) DNA polymerase that have markedly reduced activity at 37 deg...
full textDNA sequencing using Taq polymerase.
Three DNA polymerases, namely E.coli DNA polymerase 1 (Klenow), reverse transcriptase and T7 DNA polymerase (sequenase), are commonly used for DNA sequencing by the chain termination method of Sanger and colleagues [1). However, the secondary structure of the DNA template can impede the progress of all three polymerases. I have developed a novel procedure in which the thermostable polymerase of...
full textData of expression and purification of recombinant Taq DNA polymerase
Polymerase chain reaction (PCR) technique is widely used in many experimental conditions, and Taq DNA polymerase is critical in PCR process. In this article, the Taq DNA polymerase expression plasmid is reconstructed and the protein product is obtained by rapid purification, ("Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase" (Pluthero, 1993 [1]), "Single-step purification of a thermostab...
full textHeat-mediated activation of affinity-immobilized Taq DNA polymerase.
A novel strategy for heat-mediated activation of recombinant Taq DNA polymerase is described. A serum albumin binding protein tag is used to affinity-immobilize an E. coli-expressed Taq DNA polymerase fusion protein onto a solid support coated with human serum albumin (HSA). Analysis of heat-mediated elution showed that elevated temperatures (> 70 degrees C) were required to significantly relea...
full textTaq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.
Chemical modifications to DNA, such as 2' modifications, are expected to increase the biotechnological utility of DNA; however, these modified forms of DNA are limited by their inability to be effectively synthesized by DNA polymerase enzymes. Previous efforts have identified mutant Thermus aquaticus DNA polymerase I (Taq) enzymes capable of recognizing 2'-modified DNA nucleotides. While these ...
full textMy Resources
Journal title
volume 4 issue None
pages 21- 28
publication date 2014-09
By following a journal you will be notified via email when a new issue of this journal is published.
No Keywords
Hosted on Doprax cloud platform doprax.com
copyright © 2015-2023